細菌內毒素屬于制藥用水系統中另外一個最重要的關鍵質量參數。細菌內毒素是革蘭陰性菌細胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復合物，它的特殊性不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內毒素生物活性的物質。細菌內毒素的量可用內毒素單位(EU)表示，1EU與1個國際單位(IU)相當。對制藥用水系統來說，革蘭陰性菌危害最大，因為它很易形成非均勻濃度的生物膜并由此成為細菌內毒素的污染源。
　　細菌內毒素可溶于水，散裝注射用水需采取措施除去細菌內毒素，細菌內毒素體積很小，多在1~5nm,可通過超濾、納濾或反滲透裝置進行過濾去除，活性炭對細菌內毒素有很好的吸附作用，可以去除原水中的大量細菌內毒素。細菌內毒素非常耐熱，60℃下加熱1h不受影響，100℃下也不會發生熱解，180℃下3～4h、250℃下30～45min或650℃下lmin才可徹底破壞細菌內毒素。細菌內毒素能被強酸、強堿、強氧化劑、超聲波等破壞，粒子交換樹脂也能吸附細菌內毒素。細菌內毒素本身不揮發，但因具有水溶性，蒸餾時可隨著水蒸氣霧滴進入蒸餾水中。
　　制藥用水系統中用到的熱原處理方法主要包括滅活法與分離法兩大類。滅活法主要包括干熱滅菌法、酸處理、堿處理、氧化劑處理和烷化劑處理等，例如，可采用2%~5%左右的高溫堿性清洗劑循環清洗去除制藥用水系統中的生物膜與細菌內毒素。分離法主要包含活性炭吸附法、膜分離法和蒸餾法等。制備純化水與注射用水時控制細菌內毒素的方法主要包括活性炭吸附、蒸餾、超濾和反滲透等工藝。
　　熱原與細菌內毒素均有相應的檢測方法。熱原檢查法是將一定劑量的供試品通過靜脈注入家兔體內，在規定時間內觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定的一種方法，參見2020版《中國藥典》“1142熱原檢查法”。細菌內毒素檢查法是指利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。細菌內毒素檢查法具有較家免熱原檢查法靈敏、快速、簡便易行、重現性好、結果準確等優點，目前細菌內毒素檢查法已廣泛應用于制藥用水。《中國藥典》規定注射用水的細菌內毒素指標需低于0.25EU/mL,參見2020版《中國藥典》“1143細菌內毒素檢查法”。水系統中的細菌內毒素指標測試一般采用離線取樣進行分析。
　　目前，歐洲藥典委員會正在積極鼓勵用戶尋找家免熱原檢查法與細菌內毒素檢查法的替代方案，推薦方案是新熱原檢測方法,并最終計劃在大約5年內完全取代家免熱原檢查法。